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這是一個(gè)技術(shù)專欄，在這個(gè)專欄當(dāng)中，由全球診斷技術(shù)大咖為大家?guī)碓\斷技術(shù)開發(fā)方面的技術(shù)談?wù)劊覀兎浅Ｓ行已?qǐng)到了Dublin City University的Caroline Murphy博士為帶來關(guān)于免疫測(cè)試的講解。
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免疫測(cè)試的類型
在生產(chǎn)出所選擇的抗體后，必須選擇最理想的免疫測(cè)試形式。免疫測(cè)試可以分為同質(zhì)和異質(zhì)兩種形式。
同質(zhì)免疫測(cè)試不需要將與分析物結(jié)合的抗體與游離分析物進(jìn)行物理分離，其中一個(gè)例子是熒光偏振免疫測(cè)試（FPIA）。
異質(zhì)免疫測(cè)試涉及分離游離分析物和抗體結(jié)合的分析物，其中一個(gè)例子是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。
免疫測(cè)試方法可以進(jìn)一步細(xì)分為“免疫測(cè)試”和“競(jìng)爭(zhēng)”免疫測(cè)試（圖1）。免疫測(cè)試法需要使用兩個(gè)特定的檢測(cè)分子（通常是抗體），也被稱為三明治測(cè)試法。
固定的抗體通過與分析物的一個(gè)表位結(jié)合來捕獲分析物，然后第二個(gè)標(biāo)記的抗體結(jié)合，由于標(biāo)簽而產(chǎn)生的信號(hào)量與樣品中分析物的濃度成正比（圖1）。
在競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)中，標(biāo)記的（“示蹤劑”）抗原和游離的抗原（來自要分析的樣品）競(jìng)爭(zhēng)性地與固定化的抗體結(jié)合。樣品中分析物的水平越高，可用于結(jié)合的標(biāo)記抗原的數(shù)量就越少。因此，產(chǎn)生的信號(hào)與游離抗原的濃度成反比，如圖1中的曲線所示。
免疫測(cè)試法通常用于檢測(cè)分子，如蛋白質(zhì)和病毒，因?yàn)檫@些實(shí)體有能力促進(jìn)兩個(gè)或多個(gè)抗體的結(jié)合。
競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)試法通常用于檢測(cè)小分子，如藥物和毒素。競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)試使用一個(gè)分析物特異性檢測(cè)抗體和一個(gè)“示蹤劑”分子，它是目標(biāo)分析物的一個(gè)標(biāo)記版本。示蹤劑經(jīng)常被標(biāo)記為一種酶或熒光體，能夠產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。
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選擇一個(gè)合適的免疫分析技術(shù)
為了確定樣品中存在的分析物的濃度，可以使用一些基本技術(shù)。每種技術(shù)都有其獨(dú)特的特性，這使其適合于識(shí)別不同類型的分析物，從細(xì)菌到內(nèi)源性蛋白質(zhì)到病毒和毒素。還必須考慮要檢測(cè)的分析物的性質(zhì)（大小、結(jié)構(gòu)，以及是細(xì)胞質(zhì)、周質(zhì)還是膜結(jié)合）。
2.1｜免疫測(cè)試法
有許多不同的免疫測(cè)試方法可以使用，這些方法將在下面的內(nèi)容中概述。
如圖2所示，直接抗體免疫分析涉及將分析物被動(dòng)地或主動(dòng)地涂在固體表面上。將已知濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)稀釋并加入到平板中，然后在設(shè)定的時(shí)間和溫度下孵化（例如4℃過夜，室溫兩小時(shí)或37℃一小時(shí)）。
對(duì)表面進(jìn)行封閉和清洗，以消除非特異性結(jié)合，并去除任何未結(jié)合的分析物。加入抗原特異性標(biāo)記的抗體，測(cè)量產(chǎn)生的信號(hào)。
圖2 | 直接免疫分析法。(A) 應(yīng)用樣品分析物并與固體表面結(jié)合。在封閉和清洗步驟之后，（B）引入特異性檢測(cè)抗體，產(chǎn)生信號(hào)。
間接免疫測(cè)試法可用于檢測(cè)樣品中與特定抗原結(jié)合的抗體（圖3）。首先將目標(biāo)抗原涂在一個(gè)固體表面上。將適當(dāng)稀釋的血清樣品涂抹在涂抹的抗原上，樣品中存在的任何抗原特異性抗體將被結(jié)合。
清洗（例如用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）清洗3次），以去除任何未結(jié)合的抗體和任何非特異性抗體與抗原的相互作用。然后應(yīng)用物種特異性的酶聯(lián)抗體，加入酶的底物，酶將底物轉(zhuǎn)化為彩色或熒光產(chǎn)物，并測(cè)量信號(hào)。
例如，間接免疫測(cè)試法已被用于檢測(cè)人類免疫缺陷病毒（HIV）抗體的存在[24]。自1980年代以來，間接ELISA被用于檢測(cè)抗HIV抗體。2015年，Jeong和Ahn使用DNA編碼的金納米粒子（GNPs）開發(fā)了一種現(xiàn)代版的間接免疫測(cè)試法，稱為“反向間接”免疫測(cè)試法，以檢測(cè)多種病毒分析物。
他們的系統(tǒng)被稱為“金納米粒子增強(qiáng)的寡核苷酸連接的免疫吸附試驗(yàn)”（GNP-OLISA）。DNA鏈圍繞著GNP并與HIV、丙型肝炎病毒（HCV）和乙型肝炎病毒（HBV）的抗原結(jié)合，產(chǎn)生Ag-GNP-DNA顆粒。
將加標(biāo)記的人血清樣本（含有針對(duì)HIV、HCV和HBV的抗體）加入到多重檢測(cè)中。同時(shí)，在96孔板上涂上抗人類IgG，將樣本加入孔中進(jìn)行捕獲。
使用了三種不同的RNA熒光探針，由RNAse H裂解產(chǎn)生的熒光信號(hào)與相應(yīng)病毒的抗體量成線性比例。為了提高篩查效率和檢測(cè)靈敏度，還加入了納米顆粒。
三明治免疫分析的關(guān)鍵原理是使用一個(gè)捕捉抗原的抗體，然后再加入一個(gè)與單獨(dú)表位結(jié)合的檢測(cè)抗體。
為了進(jìn)行有效的測(cè)量，抗原必須足夠大，以包含兩個(gè)抗原位點(diǎn)（表位），每個(gè)抗體都能充分無阻地進(jìn)入，它允許對(duì)樣品分析物進(jìn)行檢測(cè)和定量（圖4）。
對(duì)于定量，必須包括由已知濃度的待測(cè)分析物的標(biāo)準(zhǔn)品組成的標(biāo)準(zhǔn)曲線。應(yīng)包括至少8個(gè)分析物的稀釋范圍和一個(gè)陰性對(duì)照，每次測(cè)試應(yīng)一式三份。
圖4 夾心免疫分析法。(A) 應(yīng)用捕獲抗體并與固體表面結(jié)合。對(duì)表面進(jìn)行封閉和清洗，以去除任何非特異性結(jié)合的抗體并防止非特異性結(jié)合。(B) 應(yīng)用樣品分析物并進(jìn)行孵化，然后進(jìn)行第二次清洗。(C) 引入一個(gè)酶標(biāo)記的特異性檢測(cè)抗體，并加入底物，產(chǎn)生可測(cè)量的信號(hào)。
夾心免疫測(cè)試的基本步驟包括：首先是分析物特異性抗體的表面固定化，然后是封閉和清洗步驟。在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間內(nèi)使用樣品分析物，并使用酶聯(lián)檢測(cè)抗體進(jìn)行檢測(cè)。如果樣品分析物存在，檢測(cè)抗體結(jié)合，酶底物被引入，產(chǎn)生并測(cè)量信號(hào)。
2.2｜使用競(jìng)爭(zhēng)性方法檢測(cè)小分子
競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)試法通常用于測(cè)量小分子的存在和濃度，如藥物、激素和毒素。它們只需要使用一個(gè)特定的抗體。這是有益的，因?yàn)樾》肿記]有足夠的表位來促進(jìn)一個(gè)以上的檢測(cè)抗體的結(jié)合。
競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)需要一個(gè)“示蹤劑”，它是由與信號(hào)生成酶、熒光體、納米粒子或放射性標(biāo)簽相連接的有關(guān)分析物組成。競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)試在確定與其他抗原的交叉反應(yīng)性方面是有效的。在競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)試中，分析物與預(yù)先滴定的已知濃度的“示蹤劑”進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)。
產(chǎn)生一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)曲線。樣品中分析物的濃度越高，產(chǎn)生的信號(hào)越低。反之，分析物的濃度越低，產(chǎn)生的信號(hào)越高，因此產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度與分析物的濃度成反比。
競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析方法被用來測(cè)量一種叫做微囊藻毒素-LR的小分子（<1 kDa）的存在[30]。由于海藻毒素的尺寸很小，所以選擇了競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)試法，因?yàn)槲⒛以宥舅?LR只能促進(jìn)一個(gè)特定的抗體與一個(gè)表位的結(jié)合。
圖5 |?競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)試法。(A) 將共軛小分子以最佳濃度涂抹在固體表面。檢測(cè)表面被封閉和清洗以減少非特異性結(jié)合。(B) 將樣品分析物（要檢測(cè)的）和預(yù)先滴定的酶標(biāo)記的抗體的混合物涂抹并孵化。游離的分析物（小分子）與表面結(jié)合的分析物競(jìng)爭(zhēng)抗體的結(jié)合。之后是第二個(gè)洗滌步驟。(C) 未結(jié)合的抗體被洗掉。加入酶標(biāo)記的底物，測(cè)量產(chǎn)生的信號(hào)并與存在的分析物濃度成反比。
圖5概述了競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析的基本步驟。將預(yù)定的優(yōu)化濃度的抗原涂在96孔板的表面上，用適當(dāng)?shù)姆忾]劑對(duì)板進(jìn)行清洗和封閉。
將未知濃度的樣品分析物和預(yù)定量的抗體混合在一起，孵化后加入到平板上。板子被孵化了一定的時(shí)間。清洗后，加入酶結(jié)合的第二抗體，在加入發(fā)色劑或熒光底物后，產(chǎn)生并測(cè)量信號(hào)。
? ? ? ??? ? ?公司簡(jiǎn)介
德國(guó)維潤(rùn)賽潤(rùn)（Institut VirionSerion GmbH）成立于1978年，是國(guó)際知名的診斷產(chǎn)業(yè)原料生產(chǎn)商和供應(yīng)商。公司的研發(fā)和生產(chǎn)基地位于德國(guó)維爾茨堡，已通過DIN EN ISO 13485質(zhì)量體系認(rèn)證，擁有三級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室(P3實(shí)驗(yàn)室)。經(jīng)過了40余年的發(fā)展，公司構(gòu)建了豐富的生物原料產(chǎn)品線，主要包括天然抗原、重組抗原、人源化單克隆抗體和磁珠等。
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