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這是一個技術(shù)專欄，在這個專欄當(dāng)中，由全球診斷技術(shù)大咖為大家?guī)碓\斷技術(shù)開發(fā)方面的技術(shù)談?wù)?，我們非常有幸邀請到了Dublin City University的Caroline Murphy博士為帶來關(guān)于免疫測試的講解。
檢測方法可以分為“標(biāo)記的”和“無標(biāo)記的”信號系統(tǒng)。使用與酶、熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、比色標(biāo)記或納米粒子相連的抗體的免疫測試被歸類為“標(biāo)記的”（表1和表2）。
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信號產(chǎn)生
最早的抗體檢測系統(tǒng)采用了放射性標(biāo)簽。Rosalyn Yalow和Solomon Aaron Berson在20世紀(jì)50年代報(bào)告了在檢測胰島素的實(shí)驗(yàn)中首次使用放射性標(biāo)簽。與放射性工作相關(guān)的危險(xiǎn)的工作條件、廢物處理和潛在的健康問題導(dǎo)致了替代檢測系統(tǒng)的加速發(fā)展。
目前的技術(shù)更安全，不會對使用者造成重大的健康風(fēng)險(xiǎn)，而且產(chǎn)生的廢物可以在最小的不便下進(jìn)行處理。今天，放射性標(biāo)簽已經(jīng)被使用更安全的方法提供高靈敏度的檢測方法所取代，這些方法將在以下各節(jié)中詳細(xì)討論。
1.1｜酶聯(lián)免疫法
酶聯(lián)免疫法是一種用于測量溶液中有色化合物的技術(shù)。在酶的作用下，致色底物產(chǎn)生彩色化合物。過氧化物酶是一種小的酶（大約40kDa），在其底物和氧化劑過氧化氫存在的情況下，可以用來產(chǎn)生可讀的信號。
過氧化物酶可用于幫助生成發(fā)色底物（使用3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）或2,2′-氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（APTS））或光（使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）底物）。
過氧化物酶有許多異構(gòu)體，在生物技術(shù)和生物化學(xué)應(yīng)用中最常用的是植物過氧化物酶，如辣根過氧化物酶（HRP）和大豆過氧化物酶（SRP）。為了進(jìn)一步提高過氧化物酶在工業(yè)環(huán)境中的效用，Loughran等人進(jìn)行了一項(xiàng)有趣的研究。
作者復(fù)活了一個1.1億年前的活性祖先植物過氧化物酶基因，稱為“祖父”（GP）。人們認(rèn)為，在1.1億年的進(jìn)化過程中，一些酶的特性可能已經(jīng)喪失。Loughran等人將GP的特性與現(xiàn)有的過氧化物酶、HRP同功酶A2、HRP同功酶C和SBP進(jìn)行了比較。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GP顯示出適度的熱穩(wěn)定性，但在增加對H2O2的耐受性方面超過了現(xiàn)有的過氧化物酶，這是生物技術(shù)工業(yè)中的一個理想屬性。
使用過氧化物酶作為酶標(biāo)的一個優(yōu)點(diǎn)是它的體積小，在與抗體結(jié)合時很少造成立體障礙（通常以4:1的比例）。它的局限性在于，過氧化物酶反應(yīng)需要H2O2的底物，并且與含有疊氮鈉或金屬的緩沖液不相容，因?yàn)樗鼈儠惯^氧化物酶失活。
堿性磷酸酶（AP）是一種可供選擇的產(chǎn)生信號的酶標(biāo)。它的分子量約為86kDa。由于其較大的尺寸，用AP標(biāo)記抗體時必須小心，以確保結(jié)合水平不妨礙抗原結(jié)合。
AP比過氧化物酶更昂貴，但它更穩(wěn)定。使用AP的一個缺點(diǎn)是它在酸性條件下（pH<4.5），在螯合劑或無機(jī)緩沖液中會失去活性。
然而，這些屬性可以有利地用作反應(yīng)停止機(jī)制。AP的底物是無毒和相對穩(wěn)定的，例如對硝基苯磷酸酯（PNPP）在4℃下可穩(wěn)定幾個月（表2）。
1.2｜發(fā)光
發(fā)光是指電子激發(fā)的分子以可見光的形式釋放能量。當(dāng)被激發(fā)的分子返回到基態(tài)時，它會釋放出一個光子。發(fā)光的“總稱”涵蓋了一系列的檢測系統(tǒng)，包括化學(xué)發(fā)光、磷光、生物發(fā)光和熒光。
1.2.1 化學(xué)發(fā)光
化學(xué)發(fā)光是指化學(xué)反應(yīng)的能量以光的形式釋放，不需要光源的激發(fā)（與熒光不同）。發(fā)光化合物產(chǎn)生的光子可以在很短的時間內(nèi)被激發(fā)，所達(dá)到的靈敏度可以高于傳統(tǒng)標(biāo)簽所達(dá)到的靈敏度。在表2中給出了化學(xué)標(biāo)簽的例子。
可以選擇兩種方法：
1)?使用化學(xué)標(biāo)記的底物，該底物會轉(zhuǎn)化為化學(xué)發(fā)光產(chǎn)物；
2)?使用直接附著在抗體上的化學(xué)發(fā)光分子。
用產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的酶標(biāo)記配體（如抗體）經(jīng)常被使用，因?yàn)樗梢詥佣鄠€化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使反應(yīng)高度敏感。
另外，化學(xué)發(fā)光化合物可以被共價(jià)標(biāo)記到互補(bǔ)的結(jié)合伙伴之一。這是一個直接的方法，然而，存在的化學(xué)發(fā)光標(biāo)簽不多，而且抗體上的表面空間通常有限，無法容納多個標(biāo)簽。
化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)包括：快速發(fā)光、動態(tài)范圍廣、試劑穩(wěn)定性高、昂貴的試劑消耗低、孵化時間短、靈敏度高、消除背景效應(yīng)和毒性低。
1.2.2、生物發(fā)光
生物發(fā)光是指生物反應(yīng)產(chǎn)生光的現(xiàn)象。由于其獨(dú)特的特性，生物發(fā)光在用于免疫測試時常常被證明是有利的，因?yàn)樗c熒光不同，幾乎沒有相關(guān)的背景，而且它具有高的量子產(chǎn)率和快速的反應(yīng)動力學(xué)。
許多明亮的光蛋白在最黑暗的地方被發(fā)現(xiàn)。Aqueorin最初是在水母Aequoria victoria中發(fā)現(xiàn)的，它是一個穩(wěn)定的復(fù)合物，由一個凋亡蛋白（apoaequorin）、一個發(fā)色團(tuán)（coelenterazine）和分子氧組成。
重組的aequorin已經(jīng)成功地用于免疫測試，檢測激素皮質(zhì)醇。重組的aequorin與皮質(zhì)醇以不同的摩爾比進(jìn)行化學(xué)共軛，所得共軛物被評估為最高水平的生物發(fā)光。
開發(fā)包含aequorin的嵌合抗體也已被證明是有用的。apoaequorin基因被亞克隆到哺乳動物的表達(dá)載體中，抗體的恒定結(jié)構(gòu)域被光蛋白取代。這種方法比用化學(xué)方法將光蛋白連接到抗體上更可靠，因?yàn)榛瘜W(xué)修飾往往會導(dǎo)致“批次間”的變化或抗體結(jié)合活性的喪失。
當(dāng)aequorin在1962年首次被發(fā)現(xiàn)時，Shimomura等人同時發(fā)現(xiàn)了第二種蛋白質(zhì)，它也成為一種基本的生物成像工具。
綠色熒光蛋白（GFP）已被經(jīng)常用作基因編碼的熒光標(biāo)記。熒光蛋白（FP）家族已經(jīng)擴(kuò)展到1000多個變體形式，每個變體表現(xiàn)出不同的激發(fā)和發(fā)射波長，因此，都顯示出不同的顏色（如單體橙（mOrange）（激發(fā)548納米/發(fā)射562納米）到mRuby（前558納米/后605納米））。
1.2.3、熒光
熒光是一種現(xiàn)象，當(dāng)電磁能量（光子）被物質(zhì)吸收，從而激活其電子并將其提升到更高的能量狀態(tài)時，就會發(fā)生熒光。
恢復(fù)到基態(tài)的能量導(dǎo)致能量以光的形式釋放，稱為熒光。熒光只在物質(zhì)吸收光的時候發(fā)生，然而，熒光分子可以再次被激發(fā)，從而繼續(xù)循環(huán)。
發(fā)出的熒光的波長比激發(fā)的波長長，波長的變化被稱為“斯托克斯位移”。這種波長的變化是由于電子被激發(fā)和能量釋放為熒光之間的能量損失而發(fā)生的。斯托克斯位移 “的程度取決于熒光體的固有電子結(jié)構(gòu)。
熒光體在一定的波長范圍內(nèi)被激發(fā)。分子被激發(fā)得最理想的波長被稱為激發(fā)最大值。同樣地，熒光團(tuán)在一定的波長范圍內(nèi)發(fā)出熒光。
發(fā)射最大值是熒光團(tuán)發(fā)出的光（熒光）最強(qiáng)烈的波長。由于熒光團(tuán)在一定的波長范圍內(nèi)吸收和發(fā)射，所以選擇兩個具有明顯激發(fā)和發(fā)射峰值的熒光團(tuán)是很重要的，這樣它們就不會重疊，可以單獨(dú)檢測。
熒光分子可用于熒光免疫測試，作為酶聯(lián)免疫法的替代讀數(shù)?？梢岳脽晒獾孜锎鎀MB或PNPP作為AP、β-半乳糖苷酶和HRP檢測酶的底物（之前在表2中列出）。
熒光信號的產(chǎn)生受到許多不同參數(shù)的影響，包括pH值、溫度、離子濃度、干燥、光散射、淬滅和漂白，在實(shí)驗(yàn)過程中必須考慮到這些因素。
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用于信號產(chǎn)生和固定的納米材料
納米大小的實(shí)體（1~100納米之間）在免疫分析中越來越普遍，用于檢測和固定。它們允許非常低的檢測水平，并且越來越多地被用于“醫(yī)療點(diǎn)”診斷。
圖1 | 量子點(diǎn)（QD）結(jié)構(gòu)顯示了內(nèi)芯和外殼。可用于QD的內(nèi)芯材料包括硫化鋅（ZnS）、硫化鎘（CdS）、硒化鋅（ZnSe）、碲化鎘（CdTe）、硫化鉛（PbS）、PbSe/Te和CdSe/Te以及鎘汞/碲（CdHg/Te）合金。外層核心通常是ZnS。QD被高分子涂層所包圍，增加了水溶性并有利于抗體/抗原的結(jié)合。
量子點(diǎn)（QDs）是由半導(dǎo)體材料組成的熒光納米結(jié)構(gòu)，目前正被用于廣泛的生物成像技術(shù)。它們最早是由Ekimov和Onushchenko在1980年發(fā)現(xiàn)的，他們發(fā)現(xiàn)QDs可以根據(jù)其大小產(chǎn)生一系列的熒光信號。
目前，QDs可以根據(jù)其組成分為三個不同的類別。
首先，“芯型”QDs由單一材料組成，例如硒化鎘（CdSe）或硫化鎘（CdS）；
其次，“核殼型”QDs由兩種半導(dǎo)體材料組成，一種“內(nèi)核”材料嵌入“外殼”材料中（圖1）。這些“核殼”QD顯示出比“核型”QD更好的亮度和量子產(chǎn)量。
最后，第三種類型的QD是 “合金 “QD，由硒化鋅-硒化鎘（ZnSe-CdSe）組成。合金QD是獨(dú)特的，因?yàn)樗鼈兊臒晒馓匦钥梢栽诓桓淖僎D尺寸的情況下被改變。合金成分比例的改變促進(jìn)了顏色的改變。
QD已經(jīng)成為疾病檢測和診斷領(lǐng)域的一種新資源，并已被用于許多生物檢測，如基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的傳感、細(xì)胞成像和免疫檢測。
許多QD的屬性已經(jīng)被確定，以區(qū)別于熒光有機(jī)染料或蛋白質(zhì)熒光團(tuán)。這些包括：
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廣泛的激發(fā)光譜；
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窄尺寸可調(diào)的光致發(fā)光發(fā)射光譜；
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大的斯托克斯偏移；
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高量子產(chǎn)率；
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增加了光穩(wěn)定性（比熒光染料）；
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非常適用于多色應(yīng)用；
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不同種群的QDs可以被單一的激發(fā)波長所激發(fā)；
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在連續(xù)照明下具有更高的抗光漂白性。
金納米粒子（AuNPs或GNPs），由于其長時間的穩(wěn)定性，已經(jīng)越來越受歡迎。它們固有的高電子密度使它們很容易被廣泛的分析技術(shù)檢測到，例如原子力顯微鏡（ATM）、傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）和掃描電子顯微鏡（SEM）。
根據(jù)其大小，AuNPs產(chǎn)生不同的顏色；如果小于100納米，AuNPs是紅色的，而大于100納米，AuNPs是淡黃色的。由于AuNPs與抗體非共價(jià)連接，其堅(jiān)固的性質(zhì)、穩(wěn)定性和產(chǎn)生強(qiáng)烈顏色的能力，已經(jīng)成功地整合到了側(cè)向流免疫分析中。
碳納米管（CNTs）是由一層（單壁納米管（SWNT））或多層石墨烯（多壁納米管（MWNT））組成的碳圓柱體。越來越多的CNT被用于工業(yè)應(yīng)用，顯示出比典型工業(yè)纖維高10倍的抗拉強(qiáng)度。
CNTs在本質(zhì)上可以是金屬的或半導(dǎo)體的，并且可以作為抗體支持。Wan和他的同事已經(jīng)開發(fā)了它們作為免疫感應(yīng)標(biāo)簽的潛在用途，并利用它們的信號傳導(dǎo)能力。
一個通用的MWNT，共價(jià)地涂有HRP和山羊抗兔，被用作一個通用的基于電化學(xué)的檢測器來檢測癌癥標(biāo)志物、前列腺特異性抗原（PSA）和白細(xì)胞介素-8（IL-8）的存在。
該系統(tǒng)提供了非常低水平的PSA和IL-8的檢測（分別為5 pg/mL和8 pg/mL）。然而，所涉及的眾多步驟使其成為相當(dāng)密集的勞動。
? ? ? ??? ? ?公司簡介
德國維潤賽潤（Institut VirionSerion GmbH）成立于1978年，是國際知名的診斷產(chǎn)業(yè)原料生產(chǎn)商和供應(yīng)商。公司的研發(fā)和生產(chǎn)基地位于德國維爾茨堡，已通過DIN EN ISO 13485質(zhì)量體系認(rèn)證，擁有三級生物安全實(shí)驗(yàn)室(P3實(shí)驗(yàn)室)。經(jīng)過了40余年的發(fā)展，公司構(gòu)建了豐富的生物原料產(chǎn)品線，主要包括天然抗原、重組抗原、人源化單克隆抗體和磁珠等。
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