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簡(jiǎn)介 基于免疫層析原理的側(cè)向?qū)游鰷y(cè)定早作為診斷和預(yù)后工具中表現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用。側(cè)向?qū)游鰷y(cè)定的目標(biāo)分析物包括傳染病制劑、濫用藥物、激素、癌癥標(biāo)志物、食品污染物和農(nóng)業(yè)污染物[1, 2]。硝化纖維膜的測(cè)試線和質(zhì)控線中的抗原和抗體反應(yīng)導(dǎo)致的顏色形成提供了分析物的定性檢測(cè)。定性檢測(cè)可以通過(guò)定制設(shè)備轉(zhuǎn)化為定量檢測(cè)，這些設(shè)備可以將顏色強(qiáng)度或熒光量化。側(cè)向免疫層析測(cè)定（LFIA）是一種經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的技術(shù)，旨在于5-30分鐘的短時(shí)間內(nèi)快速檢測(cè)分析物[3, 4]。 LFIA的開(kāi)發(fā)策略
LFIAs的開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)主要在于抗原抗體的相互作用的膜特性的標(biāo)準(zhǔn)化方面。毛細(xì)管流速主要取決于膜的物理和化學(xué)特性。檢測(cè)的特異性和靈敏度取決于捕獲和檢測(cè)抗體的表位特異性以及檢測(cè)抗體與膠體金納米粒子的生物結(jié)合效率。條狀試劑的設(shè)計(jì)包括按樣品墊、結(jié)合墊、硝化纖維素膜和吸收墊的順序重疊排列的膜。當(dāng)我們將全血樣品作為分析物時(shí)，還需要使用額外的膜來(lái)分離血細(xì)胞和清除背景。一個(gè)典型的LFIA條帶由上述的膜組成，依次排列在塑料背板上的條帶，并被放置在特殊設(shè)計(jì)的卡盒中，以保證適當(dāng)?shù)牧魉俸头€(wěn)定性（圖1a，b）。 LFIA的重要組成部分 硝化纖維素膜 硝化纖維素（NC）膜被認(rèn)為是快速檢測(cè)條的骨架，測(cè)試線和質(zhì)控線的捕獲抗體被涂在這里。在確定硝化纖維素膜的孔徑時(shí)，必須考慮分析物的大小和樣品類型（全血、血清、血漿、尿液）。隨著孔徑的增加，膜的流速也會(huì)增加。檢測(cè)的靈敏度與孔徑大小成反比。NC膜本質(zhì)上是中性的，可以通過(guò)硝酸酯與蛋白質(zhì)的肽鍵之間的偶極-偶極作用與蛋白質(zhì)靜電結(jié)合。捕獲試劑的緩沖液的pH值必須根據(jù)所用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化，以增強(qiáng)靜電作用。 ? NC膜的孔徑范圍為1-20 μm，根據(jù)分析物的特性來(lái)選擇。NC膜可以根據(jù)孔徑大小或吸水時(shí)間來(lái)評(píng)定。隨著孔徑的減小，吸水時(shí)間增加，為抗原-抗體提供足夠的相互作用時(shí)間，從而提高檢測(cè)的靈敏度。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，建議HCG使用10 μm的膜，瘧疾和登革熱快速檢測(cè)使用15 μm的膜。通常NC膜的長(zhǎng)度為20-25 mm，寬度為3-4 mm。測(cè)試線涂層與樣品墊的距離應(yīng)至少為7 mm，測(cè)試線與質(zhì)控線之間的距離應(yīng)至少為5 mm。由于NC膜容易受潮，所以應(yīng)始終保持相對(duì)濕度（RH）低于40%的干燥狀態(tài)。在檢測(cè)的發(fā)展過(guò)程中，最好將NC膜保持在25℃，RH<40%的控制環(huán)境中，以獲得一致的結(jié)果。一旦捕獲試劑被涂在膜上，就必須使用真空干燥或37℃熱風(fēng)爐干燥1小時(shí)，甚至使用空氣干燥器進(jìn)行干燥。真空干燥不是首選，因?yàn)樗鼘?duì)批量干燥來(lái)說(shuō)是很困難的。37℃的熱風(fēng)爐中干燥1小時(shí)是合適的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)蛋白質(zhì)可以在37℃的溫度下不變性。 樣品墊 纖維素或玻璃纖維被認(rèn)為是合適的樣品墊，作為樣品分析的平臺(tái)。最好是用玻璃纖維作為樣品墊，因?yàn)樗牡鞍踪|(zhì)密度低，吸收能力強(qiáng)，能提供穩(wěn)定而均勻的樣品流向結(jié)合墊。樣品墊是LFIA中預(yù)處理的主要部位，用于減少背景噪音和非特定的相互作用。預(yù)處理包括添加阻斷劑如BSA（1%）、酪蛋白（0.1-0.5%）、明膠（0.05-0.1%）和表面活性劑如Tween-20（0.05%）、Triton X-100（0.05%）。用上述阻斷劑和表面活性劑預(yù)處理過(guò)的樣品墊（最好是在碳酸鹽緩沖液或三相緩沖液中），然后在60-70℃的熱風(fēng)爐中干燥1小時(shí)。如果是全血樣品，細(xì)胞分離膜用于支持樣品墊，并與結(jié)合墊重合。 結(jié)合墊 玻璃纖維、纖維素薄膜和聚酯被用作結(jié)合墊的材料。結(jié)合墊是納米粒子/微粒子與檢測(cè)抗體/抗原結(jié)合的位置。它應(yīng)該具有低蛋白結(jié)合性和高釋放能力。浸漬和噴灑是用來(lái)將檢測(cè)試劑涂在結(jié)合墊上的方法。應(yīng)注意檢測(cè)器顆粒在結(jié)合墊上的均勻擴(kuò)散。浸泡過(guò)的墊子可以在37℃下干燥1小時(shí)，也可以用手持式空氣干燥器進(jìn)行干燥。結(jié)合墊是LFIA的一個(gè)重要組成部分，與NC膜一樣重要。檢測(cè)抗體結(jié)合的穩(wěn)定性和釋放動(dòng)力學(xué)直接關(guān)系到檢測(cè)的靈敏度。 吸收墊 吸收墊的常用材料是纖維素薄膜，其性質(zhì)是高度極性的。它被放置在條帶的下端，吸收膜上的全部溶液，提供最大的背景清除。在某種程度上，可以通過(guò)調(diào)整吸收墊的厚度和長(zhǎng)度來(lái)提高檢測(cè)的靈敏度。增加吸收墊的厚度可以解決試紙條中的回流問(wèn)題。 捕獲試劑 大多數(shù)LFIA都是基于免疫測(cè)定（夾心法）來(lái)檢測(cè)體液中的抗體/抗原分析物。對(duì)于抗原檢測(cè)來(lái)說(shuō)，必須選擇捕獲抗體和檢測(cè)抗體，以使表位結(jié)合位點(diǎn)彼此相距較遠(yuǎn)。一旦選擇了捕獲抗體，就必須將其涂在NC膜上。與其他免疫測(cè)定相比，LFIA對(duì)捕獲抗體的濃度要求更高，每條的濃度從50到500 ng不等（條寬寬3-4 mm）。緩沖液的摩爾值和pH值對(duì)捕獲抗體在干燥膜上的正確包被和穩(wěn)定性有很大的影響。磷酸鹽緩沖液或碳酸氫鹽緩沖液是常用的，pH值必須根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)來(lái)優(yōu)化。單克隆抗體是首選的捕獲抗體，緩沖液的摩爾值應(yīng)保持在較高的水平，以使分析物有適當(dāng)?shù)幕?dòng)。為了增加捕獲抗體在NC膜上的結(jié)合，可以在捕獲試劑中使用1-3%的甲醇。 檢測(cè)試劑 檢測(cè)試劑負(fù)責(zé)LFIA中顏色的形成，這是因?yàn)樵诿庖邷y(cè)定（夾心法）反應(yīng)中發(fā)生了納米顆粒的聚集。金納米粒子是廣泛使用的與抗體結(jié)合的材料，因?yàn)樗哂卸栊院屯昝赖那蛐谓Y(jié)構(gòu)。彩色乳膠微粒子、銀納米粒子、石墨烯納米粒子也可用于LFIA的檢測(cè)試劑制備。檸檬酸三鈉還原法是制備膠體金納米粒子的既定方法，納米粒子的大小可以通過(guò)改變檸檬酸三鈉的濃度來(lái)定制。通常情況下，20-80 nm的納米顆粒被用于結(jié)合目的，40 nm是最好的選擇。顆粒大小的變化可以通過(guò)分光光度計(jì)的吸光度掃描進(jìn)行分析。納米顆粒的顏色會(huì)隨著尺寸的改變而改變（具體請(qǐng)見(jiàn)表1）。 金納米粒子-抗體結(jié)合 檢測(cè)抗體與金納米粒子的結(jié)合效率可以被認(rèn)為是成功開(kāi)發(fā)LFIA的速度限制過(guò)程。結(jié)合緩沖液的pH值必須被優(yōu)化，以使抗體分子完全與膠體金顆粒結(jié)合。pH值的優(yōu)化是通過(guò)在2M氯化鈉的存在下，在不同的pH值梯度下，將抗體和膠體金納米粒子的結(jié)合緩沖液混合時(shí)檢查聚集反應(yīng)來(lái)進(jìn)行的。在最佳的pH值下，所有的膠體金顆粒都同樣被檢測(cè)抗體結(jié)合，緩沖液中沒(méi)有自由的金顆粒。如果pH值不理想，緩沖液中的游離金顆粒會(huì)與2M氯化鈉發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致黑色的聚集反應(yīng)（表2）。 結(jié)合反應(yīng)后，抗體包被的膠體金應(yīng)該用阻斷劑如牛血清白蛋白（1%）或明膠（0.5%）進(jìn)行阻斷。最后的儲(chǔ)存緩沖液含有穩(wěn)定劑如海藻糖（1-5%）或蔗糖（5-20%）。一旦準(zhǔn)備好，抗體結(jié)合的膠體金溶液必須根據(jù)吸光度OD在儲(chǔ)存緩沖液中稀釋，然后涂在結(jié)合墊上，在37℃下干燥。常用的吸光度OD值為OD 10。結(jié)合抗體應(yīng)在溫度<25℃，相對(duì)濕度<20%的條件下保存。在控制濕度的條件下，干燥的檢測(cè)試劑在結(jié)合墊上的穩(wěn)定性可達(dá)3年。液體形式的結(jié)合檢測(cè)試劑在4℃下最多可穩(wěn)定1個(gè)月。 需要考慮的問(wèn)題 LFIA開(kāi)發(fā)過(guò)程中的故障排除
公司簡(jiǎn)介 德國(guó)維潤(rùn)賽潤(rùn)（Institut VirionSerion GmbH）成立于1978年，是國(guó)際知名的診斷產(chǎn)業(yè)原料生產(chǎn)商和供應(yīng)商。公司的研發(fā)和生產(chǎn)基地位于德國(guó)維爾茨堡，已通過(guò)DIN EN ISO 13485質(zhì)量體系認(rèn)證，擁有三級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室(P3實(shí)驗(yàn)室)。經(jīng)過(guò)了40余年的發(fā)展，公司構(gòu)建了豐富的生物原料產(chǎn)品線，主要包括天然抗原、重組抗原、人源化單克隆抗體和磁珠等。 助力我們的客戶更加強(qiáng)大 永葆我們的價(jià)值無(wú)可替代 免責(zé)聲明：本文僅代表作者本人觀點(diǎn)，不代表維潤(rùn)賽潤(rùn)資訊的觀點(diǎn)和立場(chǎng)。文章圖片均來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)，請(qǐng)聯(lián)系作者刪除,歡迎聯(lián)系小編。
金納米粒子的尺寸（nm）
顏色
70-80
黑色
60-70
深紫色
40-60
粉紫色
20-40
帶紅色的粉紅色
10-20
強(qiáng)烈的紅色
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